Omega biotek公司基因组DNA提取系列

E.Z.N.A. ® Blood DNA Midi Kit

该系列适合于D3493/D3494

说明：该中文说明书只提供用户参考使用，详细操作或说明请参照omegabiotek公司的操作说明书。

准备工作:

1.蛋白酶的准备

  1.在D3494系列的试剂盒，携带了Omega公司的蛋白酶，使用前：用300μl（2 preps）,1.5ml（10 preps）, 3.75ml(25 preps) 10mM Tris-HCl（PH 8.0）溶解OB蛋白酶,然后分装保存于-20度；

  2.在D3493系列的试剂盒，不携带Omega蛋白酶：客户需要自已购买分子生物学级的蛋白酶K后,用10mM Tris-HCl，Ph7.4,配制成20mg/ml，然后分装保存于-20度；

2.试剂盒提供的Buffer ERL是10×浓缩液，使用前必须按下表要求用灭菌水进行稀释：

a) D3493-00/D3494-00     每瓶加入180ml灭菌水

b) D3493-01/D3494-01     每瓶加入900ml灭菌水

c) D3493-02/D3494-02     每瓶加入1800ml灭菌水

3.　使用前，DNA Wash Buffer母液必须按下表要求用无水乙醇进行稀释：

D3493-00/D3494-00      加入18ml无水乙醇

D3493-01/D3494-01      加入60ml无水乙醇于各瓶中

D3493-02/D3494-02      加入150ml无水乙醇于各瓶中

A. 血液DNA常规操作方案（适合于2ml血液样品）

注意：以下方案中适合于2ml的新鲜血液；

实验流程：

a)裂解和消化细胞

1．转移2ml血液至15ml的离心管；如果血液样品不够2ml，则加入10mM Tris-Hcl，PBS或Elution Buffer（洗脱液）使整个体积达至2ml；

2．加入150μl的OB蛋白酶（D3496）或蛋白酶K（D3495），振荡均匀。加入2.1ml Buffer BL，涡旋5分钟使溶液混和均匀；

3．加入20ul RNase A以消化RNA;

4．70℃水浴10min；

5．在水浴期间，漩涡混匀一次；

b)基因组DNA吸附至柱子上

6．加入2.2ml异丙醇至裂解液中，涡旋混匀。如果起始样品是Buffy Coat，分离的淋巴细胞或培养细胞，用2.2ml无水乙醇代替异丙醇可提高产量；

7．把HiBind DNA柱子套在15ml收集管中（已提供），将第五步得到的溶液全部转入柱子中，4,000×g离心5min，弃去该收集管和流出液。

c) 洗涤去除残留的蛋白质和盐分

8．将HiBind DNA柱子套在新的15ml收集管，加入3ml Buffer HB至柱子，4,000×g离心5min，弃去流出液；

9．将HiBind DNA柱子重新套回15ml收集管中，加入4ml DNA Wash Buffer至柱子中，4,000×g离心5min,弃去流出液；

10．将HiBind DNA柱子重新套回15ml收集管中，再加入4ml DNA Wash Buffer至柱子中，4,000×g离心5min,弃去流出液；

11．将HiBind DNA柱子重新套回15ml收集管中，4,000×g离心空柱10min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。

d) 洗脱出基因组DNA

12.将柱子置于15ml灭菌离心管，加入500μl 70℃预热的DNA Elution Buffer至柱子的膜中央。 室温静置于2min；

13.室温下，4,000×g离心5min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。把柱子置于另一个15ml离心管，重复用另500μl的预热的DNA Elution Buffer离心洗脱，弃去柱子。

注意：第一次洗脱可得到60%~70%结合于柱上的DNA，而两次洗脱的总量一般可大于80%。然而，增加洗脱

体积会减少最终产物的浓度。若想得到高浓度的DNA，可使用第一次洗脱液进行第二次洗脱。

若有需要，可浓缩DNA。加入终浓度为0.1M的NaCl和2倍体积的无水乙醇。混匀完全后于-20℃放置10min，10,000×g离心15min，弃去上清液。加入700μl的80%乙醇后，以10,000×g离心2min，弃去上清，在空气中干燥沉淀并用20μl的灭菌双蒸水或10mM Tris-HCl（PH8.0）重悬DNA。

B.10 ml的血液操作方案

a) 裂解红细胞，收集白细胞

1.1倍体积的新鲜全血（最大量为10ml），加入5倍体积的1×ERL Buffer。即：10ml新鲜全血加入50ml　1×ERL Buffer，轻轻涡旋或颠倒混匀。

该试剂盒提供ERL Buffer溶液是10×的浓缩液，使用前必须按说明书或瓶子上标鉴指示进行稀释成1×的浓缩液。

2.冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次。血红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。如果血液样品来自ECR或血小板升高的患者，冰上放置时间需延长至20分钟；

3.收集白细胞：4℃，450×g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃含有已裂解红细胞的上清液；

4.加入两倍体积的1×ERL Buffer，轻轻涡旋充分重悬白细胞。

技巧：如果起始血液为10ml，则加入20ml的1×ERL Buffer。

5.4℃，450×g离心10分钟沉淀白细胞，小心并彻底吸去含有已裂解红细胞的上清液；技巧：小心倒弃溶液后，将离心管反置于吸水纸上1分钟，便可吸尽上清液；或短暂离心，将管壁上的液滴甩到管底，再用移液枪小心吸弃任何残留的溶液。

b) 裂解和消化细胞

6.加入2ml Buffer TL至白细胞沉淀物中，涡旋混匀；

7.加入150μl的OB蛋白酶（D3496）或蛋白酶K（D3495），振荡均匀。在55℃水浴中振荡孵育至细胞完全裂解。如果没有振荡孵育水浴可用，孵育其间每隔20-30分钟振荡一次。

技巧：裂解时间取决的所用的细胞量，一般2小时就能获得良好的消化效果。

8.可选步骤：加入20ul RNaseA(20mg/ml)至裂解液中，以去除RNA污染；

9.加入2.1ml Buffer BL涡旋混匀，70℃水浴10min；

      加入Buffer BL后可能会形成一些沉淀，但是不影响DNA提取；

10.加入2.2ml无水乙醇，涡旋混匀。如果这一步可看到明显的沉淀，用注射器抽打以打断这些沉淀；

     注意：以下所有的离心步骤都必须在8000×g的离心机中进行。

c)基因组DNA吸附至柱子上

11.把HiBind DNA柱子套在8ml收集管中（已提供），转移3.5ml裂解液（第10步的所得溶液，包括所有的沉淀物）至柱子中，8,000×g离心10min滤过溶液以吸附DNA，弃去流出液。

12.将柱子套回收集管，将剩余裂解液（第10步所得溶液）转移至柱子上，8,000×g离心10min滤过溶液以吸附DNA，弃去流出液。

d)洗涤去除残留的蛋白质和盐分

13.将HiBind DNA柱子套在新的8ml收集管，加入3ml Buffer HB至柱子，8,000×g离心10min，弃去流出液；

14.将HiBind DNA柱子重新套回8ml收集管中，加入3.5ml DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；

15.将HiBind DNA柱子套在8ml收集管中，再加入3.5ml DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心10min,弃去流出液；

16.将HiBind DNA柱子重新套回8ml收集管中，8,000×g离心空柱10min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。

e)洗脱出基因组DNA

11.将柱子置于15或20ml灭菌离心管，加入1-2ml 70℃预热的DNA Elution Buffer或灭菌水（TE Buffer）至柱子的膜中央。室温静置于2min；

12.室温下，8,000×g离心5min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。把柱子置于另一个8ml离心管，重复用另1-2ml 70℃预热的DNA Elution Buffer或灭菌水（TE Buffer）至柱子的膜中央，离心洗脱，弃去柱子。

注意：第一次洗脱可得到60%~70%结合于柱上的DNA，而两次洗脱的总量一般可大于90%。然而，增加洗脱

体积会减少最终产物的浓度。若想得到高浓度的DNA，可使用第一次洗脱液进行第二次洗脱。

若有需要，可浓缩DNA。加入终浓度为0.1M的NaCl和2倍体积的无水乙醇。混匀完全后于-20℃放置10min，10,000×g离心15min，弃去上清液。加入700μl的80%乙醇后，以10,000×g离心2min，弃去上清，在空气中干燥沉淀并用20μl的灭菌双蒸水或10mM Tris-HCl（PH8.0）重悬DNA。