注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TB281。
介绍
AMV 反转录酶利用总RNA 或Poly(A)+RNA 合成单链cDNA。反转录系统提供经过检验的试剂，能够在15 分钟之内对总RNA 或Poly(A)+RNA 进行高效的反转录。同时提供一个1.2kb 多聚腺苷酸尾的转录本作为cDNA 合成反应的对照模板。利用反转录系统合成的cDNA 可直接用于PCR 反应。
A.反转录反应
反转录反应可以利用Oligo(dT) 15 或随机引物随机引物引导。如果需要由3’Poly(A) 区域引导，选用Oligo(dT) 15 引物；如果需要引导全长RNA，选用随机引物。当使用cDNA 进行克隆及PCR 反应时，通常选择Oligo(dT) 15 引物。如果cDNA 用于RT-PCR , 有时随机引物比较合适，特别当PCR 引物定位于RNA 5’-末端时更是如此。
1.将1μg（2μl）1.2kb卡那霉素阳性对照RNA，Poly(A)+ mRNA或总RNA 加入微量离心管中并于70 oC 温育10 分钟。短暂离心后置于冰上。
2.依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20μl 的反应体系。
（依据RNA 的量，反应体积可以增减）：
组分 量
MgCl2, 25mM* 4μl
反转录10 X 缓冲液 2μl
dNTP 混合物, 10mM 0.5μl
重组的RNasin® 核糖核酸酶抑制剂 2μl
AMV 反转录酶（高浓度） 15u
Oligo(dT)15 引物或随机引物 0.5μg
1.2kb 卡那霉素阳性对照RNA (2μl) 1μg
或Poly(A)+ mRNA 或总RNA
加无核酸酶的水至终体积为量 20μl
*推荐的MgCl2 浓度可根据已知序列进行优化以得到较高产量。
3.如果使用Oligo(dT)15 引物，将反应体系于42 oC 温育15 分钟。如果使用随机引物，将反应体系于室温温育10 分钟，然后于42 oC 温育15 分钟。增加的室温温育步骤有利于引物的伸展，使得当温度升高到42 度 时引物仍处于杂交状态。
4.将样品于95 度加热5分钟，然后于0-5 度放置5分钟。这一步将使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合。第一链cDNA可用于第二链cDNA的合成或琼脂糖凝胶分析。
注意：
1.建立反应体系前，将以下试剂根据需要进行分装：水，缓冲液，dNTPs，MgCl2, 重组RNasin® 核糖核酸酶抑制剂。这样做可以减少移液的次数并提高反应的准确性。
2.可以用特异性下游引物（由使用者提供）代替Oligo(dT)15 引物或随机引物。特异性引物的浓度应根据反转录的种类进行调整。例如，当使用一个24mer 的引物与1.0μg 的对照模板RNA 杂交时，需要800ng（100pmol）引物。当相同的引物与总RNA 样品中的特异性RNA 杂交时，只需要少至120ng（15pmol）引物。特异性引物的典型长度为19-30 个碱基。
3.为了得到更长和/或更丰富的转录本，可以将cDNA 反应于42oC 温育时间延长至60 分钟。
4.在cDNA 合成时，与M-MLV 反转录酶（Cat.#M1701）相比，AMV反转录酶的用量要少很多。
5.已经证明，提高反转录的温度（45-50度）可以解决RNA 二级结构的问题。
6.本系统提供的1.2kb 卡那霉素阳性对照RNA 经10 倍的系列稀释后已用于扩增反应。使用上述方法我们最少能够检测到2.5 attomoles的对照RNA。
B. PCR 扩增反应的稀释
1. 用TE 缓冲液或无核酸酶的水将第一链cDNA 合成反应的体积稀释到100μl。
2. 将下列试剂混合在一起以配制100μl 扩增反应体系。注意：模板特异的上游或下游引物必须在此时加入。
组分 量
第一链cDNA 反应 10-20μl
dNTP 混合物, 10mM 1.8μl
MgCl2, 25mM* 7.5μl
反转录10 X 缓冲液 9.8μl
上游引物 50pmol
下游引物 50pmol
Taq DNA 聚合酶 2.5 单位
加无核酸酶的水至终体积 100μl
注意：
1. 与使用Oligo(dT)15 引物相比，使用随机引物进行反转录时有不同的温度要求。
2. 如果扩增反应体积较小，则加入的cDNA的量应相应减少。
3. 根据自己的经验使用热循环仪。 |
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