E.Z.N.A. ^® Fastfiler Endo-free Plasmid Maxiprep Protocol(无内毒素质粒大抽提)

1.   在1-4升的培养瓶中加入200-500ml LB培养基,然后加入菌种于37℃摇床培养12-16小时；

Tip:为获得最好的结果，请接种1ml培养过夜的菌种（12-16hr）。并强烈推荐使用E.coli(endA^-)品系用于常规的质粒提取，如DH5a和JM109。注意：菌液的培养时间不能超过16小时；

2.   收集200ml培养基至适当的离心管，室温下，3,500-5,000×g离心10分钟沉淀；

3.   吸尽并去除培养基，用干净的吸水纸吸尽壁上多余的液体。加12.0ml Solution I/RNase A到细菌培养物中，涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞；

注：充分重悬细菌沉淀物对获得高产量的质粒是相当关键的。充分重悬后溶液是均匀的，不存在小块物质；请尽量吸弃残余的培养基以防止稀释加入的溶液；

4.   加入12.0ml SolutionII，轻轻颠倒旋转混匀7-10次至获得澄清的裂解液；室温放置3-5分钟可以有是必须的。避免剧烈振荡混匀而打断染色体DNA，降低质粒的纯度。（Solution II使用后请盖紧盖子且于室温保存）；

5.   将取出Lysate Clearance Filter Syrine活塞，将其放置于架子上；

6.   加入12 ml Neutralization Buffer，轻轻颠倒混匀几次至出现絮状沉淀。这可能需要放置2-3分钟并间断颠倒混匀；

7.   立即将裂解液转移到lysate Clearance Filter Syrine中，垂直放置5分钟。这时白色的絮状沉淀物会漂上溶液的上层，裂解液可能开始流出过滤器，用新的50ml管子收集细菌裂解液，并将活塞轻轻插入过滤器中；

8.   握住过滤器，轻轻推动活塞将裂解液打到收集管中；注意不要将任何杂质打到收集管中；

9.   加入0.1体积的ETR Solution（蓝色）到收集液中，轻轻颠倒旋转混匀7-10次，冰浴放置20分钟；注意：加入ERT Solution后，溶液应变得浑浊，但冰浴静置后溶液应是澄清的。

10.  37℃孵育5分钟，溶液重新变为浑浊。室温下，3,000×g离心5分钟，ERT Solution（蓝色）分层于离心管底部。

11.  把上面的水相（上清液）转移到新的50ml离心管中，加入1/3体积的GBT Buffer，轻轻颠倒旋转混匀1-2次。注意：转移上清液时不要吸到任何ETR溶液，因为其含有高浓度的内毒素；

12.  平衡DNA柱子：用HiBind DNA Maxi Column套在收集管中，加入10ml Buffer GPS至HiBind DNA Maxi柱子中，室温下3000×g离心2分钟；去除滤过液并重复使用收集管；

13.  加入23ml澄清的裂解液至DNA柱子中，3,000×g离心2分钟。去除滤过液并重新收集管；

14.  将剩余的裂解液加到柱子上，按上述条件离心，去除滤过液并重新使用收集管；

15.  加入10ml Buffer HB至柱子中，3000×g离心2分钟，去除滤过液并重新使用收集管；

16.  加入15ml DNA Wash buffer(已用乙醇稀释)至柱子中，3000×g离心2分钟，去除滤过液并重新使用收集管；

17.  加入10ml DNA Wash buffer至柱子中，3000×g离心5分钟，去除滤过液和收集管；

18.  将柱子套在新的50ml离心管中，加入1-3ml DNA Elution Buffer或水至柱子的基质。室温下,3000×g离心洗脱DNA。

E.Z.N.A. ® Fastfilter Endo-free Plasmid Maxiprep Protocol(Vacuum Protocol)

1.   按1-11步骤准备澄清的裂解液；

2.   平衡柱子：将HiBind DNA Maxi Column同真空装置相连接，加入10ml Buffer GPS至柱子中，提供真空1分钟至裂解液完全滤过膜；

3.   将澄清的裂解液至HiBind DNA Maxi柱子中，提供真空让所有的溶液滤出柱子；加入10ml HB Buffer至柱子，提供真空吸尽液体；

4.   加入15ml DNA Wash buffer（已经用无水乙醇稀释）至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；

5.   重用15ml DNA Wash buffer至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；溶液滤出柱子后， 将柱子转移至50ml收集管中，另外提供真空10分钟，室温下，3000×g离心5分钟以洗脱DNA。第二次洗脱可能是需要的；

6.  去除柱子，然后将产物保存于-20℃。