a)收集细菌，去除细胞壁
1． 在LB培养基培养细菌至指数生长期。一般培养过夜（12-14小时）的细胞就足够。
2． 转移≤3ml培养液，室温下，4000×g离心10min收集细菌。
3． 尽量倒去培养基，加入100μl TE缓冲液完全悬浮细菌；如果是革兰氏阴性细菌则加入10mg/ml的溶菌酶10μl，混匀后放于30℃孵育5 min；如果是革兰氏阳性细菌则加入10mg/ml的溶菌酶100μl，混匀后放于30℃孵育最少10min。
注：溶菌酶的用量和消化时间取决于所用的菌种，完全充分的消化细胞壁对细菌的高效消化是相当关键的。
4． 室温下以4000×g离心5min收集已消化细胞壁的细菌。
b)蛋白酶K，消化细菌
5． 加入200μl Buffer BTL重悬细胞，加25ul蛋白酶K（15mg/ml），涡旋混匀，于55℃恒温水浴摇床中孵育至细菌完全裂解，如果没有水浴摇床，则每20~30min涡旋振荡样品一次。细菌的裂解时间随细菌的种类及用量的不同而不同，但一般在1小时之内就能消化完全；
6． 可选择步骤：纯化的DNA产物中含有RNA污染，并不会影响PCR反应，但是可能会影响其它下游应用。如果需要去除RNA污染的话，则在这里可以加入20μl 25mg/ml的RNA酶A，并在室温下放置2min，继续此方案。
7． 加入220μl Buffer BDL，涡旋混匀，并在70℃下水浴10min。在加入Buffer BDL后可能会形成一小团的沉淀，并不会影响DNA的提取。
8． 加入220μl无水乙醇并充分地涡旋振荡。
c)吸附基因组DNA
9． 把一Hibind®自旋柱装在一个2ml收集管上。把第8步得到的样品（包括可能形成的所有沉淀）全部转移到柱子内。8,000×g离心1min以结合DNA，弃去流出液和收集管。
d)洗涤去除杂质
10． 把柱子装到一新的2ml收集管上，加入750μl DNA Wash Buffer（已用无水乙醇稀释）于柱子中，8,000×g离心1min以洗涤柱子，弃去流出液，收集管再继续下一步使用。
注：DNA Wash Buffer在第一次使用之前必须按要求加入无水乙醇稀释。
11． 柱子重新套回2ml收集管，加入750μlDNA Wash Buffer，8,000×g离心1min以洗涤柱子，弃去流出液。
12． 柱子重新套回2ml收集管， ≥10,000×g离心空柱2min以甩干柱子。这一步对确保下步中得到最理想的洗脱条件是至关重要的。
e)洗脱DNA
12. 把柱子套在1.5ml离心管中，加入50-200μl 70℃预热的DNA Elution Buffer（也可以是dH2O或TE，pH8.5）至柱子的膜中央，室温下放置1min。
13． 室温下，8,000×g离心1min从柱子上洗脱出DNA。如果有需要可以另取50-200μl预热的 DNA Elution Buffer再洗脱一次。加入洗脱液后，将柱子放置于70℃，水浴1-2分钟可以提高每次洗脱的DNA的产量。
f)产量与质量的测定
DNA的产量可由分光光度计检测，用双蒸水、Tris-Hcl或DNA Elution Buffer作空白对照。一般3ml的细菌培养液可以抽提到15-30μg的DNA。提取的产品保存在-20℃以防止降解。DNA浓度可按以下公式计算：
[DNA]=（A260）×（0.05μg/μl）×稀释倍数
DNA的质量可通过比较在260nm和280nm处的吸光度估计得到。A260/A280的比率在1.7~1.9
就相当于85%~95%的纯度。 |
