1. 在10-20ml的培养管中加入5ml YDP培养基，加入菌种于30℃摇床振荡培养12-16小时；

注：菌中培养时间不能超过16小时；

2. 收集1.5-5ml培养液，室温下，12,000×g离心1分钟；

3. 尽量吸弃培养基，然后加入250ul YP I/RNase A至酵母沉淀物；涡漩重悬细胞。注：充分重悬细胞对获得高产量质量是相当重要的。

→Tip:残留的培养基会影响裂解效果，因此必须尽量吸弃培养基，可倒弃培养基后，短暂离心，用枪头吸尽培养基，以彻底去除残留的培养基。

注：有些实验证明用溶菌酶预先处理酵母能提高质粒的产量。如果用YPII裂解细胞有问题或回收的产量很低，在第3步之前按以下步骤进行：

按以下配方准备Buffer SE：

　　1 M     　山梨(糖)醇(Sorbitol)

        100mM  　　 EDTA

        14mM   　　ß-巯基乙醇

    用500ul Buffer SE和200单位的溶菌酶重悬细胞，并于30℃孵育30分钟；室温下，4,000×g离心5分钟沉淀芽胞；

4. 加入250ul YPII，轻轻颠倒和旋转混匀4-6次至获得澄清的裂解液。室温放置5分钟可能是必要的。避免剧烈混匀以防止打断基因组DNA而降低质粒的纯度；

5. 加入350ul YPIII，轻轻颠倒混匀几次至获得絮状的沉淀物止。室温下，10,000×g离心10分钟；

→Tip:如果离心后蛋白质和基因组DNA沉淀物还残留在溶液中，可适当提高离心速度和延长离心时间。一般情况下，10,000×g离心10分钟足以离心沉淀；

6. 将HiBind 小量柱子套在2ml的收集管中，小心将上清液转移到柱子上。转移上清液时，不要将沉淀物转移到柱子中。室温下，10,000×g离心1分钟，让上清液流过柱子；此时质粒已结合至柱子上；

→Tip:在转移上清液时，尽量不要吸到任何沉淀物，因为这些沉淀会影响到纯度，也可能会导致柱子阻塞；

7. 弃去滤出液，柱子重新套回收集管中，加入500ul Buffer HB。室温下，10,000×g离心1分钟；

→加入Buffer HB溶液洗涤可以去除残留的蛋白质，提高质粒的纯度。

8. 弃去滤出液，柱子重新套回收集管中，加入750ul Wash Buffer(已用无水乙醇稀释)，10,000×g离心1分钟，弃去滤出液；

9. 可选步骤：用另外750ul Wash Buffer重新洗涤柱子一次；

10. 室温下，10,000×g离心空柱1分钟以干燥柱子。

→不要忽略此步，能去除柱子中残留的乙醇；

11. 将柱子套在一干净的1..5ml离心管中，加入50ul-100ul灭菌水去离子水或TE缓冲液（加入的量取决于预期的产物浓度）至柱子的膜中央。室温下，10,000×g离心1分钟以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出75-80%柱子上的DNA。第二次洗脱可以洗出残留的DNA，但是浓度较低。

→加入灭菌水后，室温放置2-3分钟可能可以提高质粒的产量；

12. DNA纯度和产量：将样品稀释20至50倍，在紫外分光光度计测260nm或280nm吸光值：

DNA浓度（ug/ml）＝OD₂₆₀×50×稀释倍数

    虽然HiBind DNA柱子的结合能力可以达到25ug，但是酵母质粒的产量取决于酵母和质粒的类型。一般情况下，高挎贝数的质粒，可在5ml的培养物提取1ug的质粒DNA。