真核细胞或组织的RNA提取操作方案

1. 加入400ul TRK Lysis Buffer裂解细胞或组织；在开始实验之前，请在1ml TRK Lysis buffer溶液中加入20ul 2-mercaptoethanol。400ul TRK Lysis Buffer用于10⁷个细胞或40mg组织，对于较特别的组织，超过10⁷个细胞或40mg组织，请用700ul TRK Lysis Buffer，但是不要超过50mg的组织；

注：a) 对于单层贴壁的组织培养细胞（如成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在培养瓶中进行裂解细胞：彻底吸弃培养瓶中的培养液，直接加入TRK Lysis Buffer至培养瓶中：对于T35培养瓶或10cm培养皿，加入700ul TRK Lysis Buffer；对于小型的培养瓶，可加入400ul TRK Lysis Buffer．用枪头吹打溶液至整个瓶壁，以确保细胞完全从壁上放脱出来并完全裂解；转移裂解液至新的干净的1.5ml离心管中，按着第2步操作；

b) 对于悬浮培养的细胞，室温下，不超过1500rpm(400×g)离心5分钟以收集细胞，去除上清液，加入400ul TRK Lysis Buffer，涡旋或枪头抽打裂解细胞，将样品转移至1.5ml的收集管中，按着第2步操作；

c) 对于组织样品，按上述匀桨方法进行匀桨；组织完全裂解后，可室温下，10,000×g离心10分钟，去除不溶解的杂质，防止堵塞柱子；

2. 匀浆步骤：

a) 将匀浆柱套在收集管中，然后将裂解液加到匀浆柱上，室温下，10,000×g离心2分钟，将过滤液转移至新的离心管中。匀浆柱可以起到裂解细胞，打断高分子量DNA降低溶液粘稠度和过滤不溶解杂质的作用；这一步可以提高HiBind RNA Spin柱子的结合能力和减少柱子堵塞的情况，注意：过滤后，收集管底部可能会形成一些沉淀，在转移上清液时，不要吸到任何沉淀。

b) 用机械匀浆器交浆30秒；

c) 用一次性的#20号小型针头的注射器抽打裂解液至少5次；

3. 加入等倍体积（400ul-700ul）的70%乙醇至裂解液，涡旋混匀；这一步可能会形成一些沉淀，但是不影响以下的操作。

注意：加入70％乙醇后可能会产生一些沉淀物，但不会影响RNA的分离；70％的乙醇

必须用DEPC处理过的灭菌水来配制，否则70％乙醇中残留的RNaseA会降解RNA。

4. 将HiBind RNA Spin柱子套在2ml收集管中，该柱子一次性最多可以容纳800ul的溶液。将上述溶液（包括沉淀）转移至柱子上，室温下，10,000×g离心1分钟，以完全滤过溶液。如果还有溶液残留，请延长时间至溶液完全滤过柱子，去弃滤过液。继续将剩余的裂解液转移至柱子，离心弃去滤出液；

Tip：如果在离心后，柱子发生堵塞，可延长离心时间或提高离心速率至裂解液完全流出柱子。柱子发生堵塞的原因有以下几种原因：1.样品起始量太多；2.裂解不够充分；建议：1.　减小样品量，提高匀浆效率；2.　裂解完后，用匀浆柱过滤裂解液。

5. 将柱子套回2ml收集管中，加入300ul Wash Buffer I至柱子上，按上述条件离心，弃去滤出液，重复使用收集管．如果需要柱上进行DnaseI消化处理，请按第5步操作，否则按第6步操作；

6. Dnase酶消化处理（可选）

由于HiBind RNA柱子不经任何处理就能去除大部分的DNA，因此大部分应用并不需要特别的DnaseI消化处理，然而对于灵敏的实验（如RT-PCR）则需要去除基因组DNA的污染，按膜上DnaseI消化处理方案进行（DnaseI Cat # E1091）

A 对每个柱子，按下表配制混合液

注意：

(1) Dnase I 是相当容易变性的蛋白质，请不要涡旋DnaseI混合物，轻轻颠倒混匀．

(2) OBI Dnase I消化缓冲液也在试剂盒中提供；

(3) 常规的Dnase buffer不适合于膜上消化处理；

7. 将柱子放置于2ml收集管中，加入500ul RNA Wash Buffer I.(如果前面有膜上Dnase I处理，加入RNA Wash Buffer I后请放置5分钟)；室温下，10,000×g离心1分钟，去除滤过液；

8. 将柱子套回离心管，加入500ul RNA Wash Buffer II(已用无水乙醇稀释)，室温下，10，000×g离心1分钟，去弃滤过液；

注意：在使用Wash Buffer II之前，必须用无水乙醇进行稀释。按瓶子标鉴或说明书用无水乙醇稀释Wash Buffer II。

9. 将柱子套回离心管，加入500ul RNA Wash Buffer II，室温下，10,000×g离心1分钟，去弃滤过液。将柱子套回空的收集管，室温下，10,000×g离心空柱1分钟，以甩干柱子的基质；

10. 洗脱RNA：将柱子转移至新的1.5ml的收集管中，加入40-100 DEPC-水至柱子的膜中央。放置1分钟。室温下，10,000×g离心1分钟。如果RNA>50ug，第二次洗脱可能是必需的。

电泳检测：

    电泳分析RNA时，请用专门的电泳槽进行RNA电泳。如果没有专门的RNA电泳槽，也可以用3%双氧水浸泡电泳槽和梳子等，过夜浸泡，然后用DEPC水冲洗电泳槽两次，所用的电泳液缓冲液不需DEPC处理。用于电泳分析RNA的方法可以分成两种：

1. 常规的琼脂糖凝胶：配制1.0％琼脂糖凝胶分析即可；

2. 变性胶分析。

一般情况上，常规的琼脂糖凝胶就可以分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条带，分别为：28S,18S，有时候也可以看到5S的带。

从含纤维丰富的组织中提取RNA(骨骼肌肉，心脏和动脉组织等)

1. 从动物中取出组织或者取出冻冷藏的组织；

2. 取出10mg的组织，放置于1.5 ml离心管；

3. 加入300 ul TRK Lysis Buffer，用匀浆器或玻璃奶进行匀浆；

注：不完全的匀浆去会使柱子的阻塞，减少产量；一般情况下，用研磨或注射器会产减少产量，这里我们推荐使用转头匀浆器或玻璃奶匀浆系统；

4. 加入590ul　DEPC处理水，混匀后加入OB 蛋白酶吸打混匀；

5. 55℃消化10分钟；

6. 室温下，10,000×g离心5分钟。离心后，在管底会有些不溶解的沉淀，在溶液的表面也会有层不溶解的物质。

7.（可选步骤）将匀浆柱套在2ml收集管中，将上清液小心转移到匀浆柱中。室温下，10,000×g离心2分钟。

8. 在第六步（或第七步）的上清液小心转移至新的离心管中，注意在转移过程中，不要吸到任何不溶解物质。

9. 加入450ul的无水乙醇（96-100%）至澄清的裂解液，涡旋混匀。

10. 将HiBind RNA 柱套在2ml收集管中，转移700ul裂解液（包括所有的杂质）至柱子上。

11. 室温下，10,000×g离心1分钟，去除过滤液。将柱子重新套回2ml收集管中；

12. 将剩余的裂解液加到柱子上，室温下，10,000×g离心1分钟，去除过滤液。

13. 将柱子套在新的2ml收集管中，加入500ul RNA Wash Buffer I，室温下，10,000×g离心1分钟，去除过滤液。

14. 将柱子套回2ml收集管中，加入500ul RNA Wash Buffer II，室温下，10,000×g离心1分钟，去除过滤液。

15. 将柱子套在新的2ml收集管中，重复加入500ul RNA Wash Buffer II，室温下，10,000×g离心1分钟，去除过滤液。

16. 将柱子套回2ml收集管中，室温下，10,000×g离心空柱1分钟以甩干柱子膜上的乙醇。——这一步对去除残留的乙醇是相当的关键的，不要省略。

17.  洗脱RNA：将柱子转移至新的1.5ml的收集管中，加入40-100 DEPC-水至柱子的膜中央。室温下，10,000×g离心1分钟。如果RNA>50ug，第二次洗脱可能是必需的。

从全血样品中提取RNA

该方法能从100ul的全血样品纯化足够的RNA用于RT-PCR等检测，对于更高效率的RNA纯化，请用Blood RNA Kit。

准备工作：在450ul TRK Lysis Buffer/2-Mercaptoethanol中加入蛋白酶K，使其终浓度为4mg/ml。该操作方案已经成功地检验过各种抗凝的新鲜的血液样品。

1. 转移100ul的全血样品至离心管中；

2. 加入350ul TRK Lysis Buffer/2-Mercaptoethanol（包括4mg/ml蛋白酶K），涡旋30秒混匀溶液；

3. 70℃孵育10分钟；其间颠倒混匀样品两次；

4. 室温下，10,000×g离心3分钟，转移450ul的上清液至新的离心管中；

5. 加入225ul无水乙醇，涡旋10秒混匀；然后按常规操作的第四步，上柱吸附RNA。