由于凋亡在发育、自我稳态调节和多种重大疾病中扮演着重要角色，因此对凋亡的遗传、分子和形态学方面的研究正在深入地进行。Promega的DeadEndTM Colorimetric Apoptosis Detection System（以下称DeadEndTM比色法凋亡检测系统）对凋亡的生化标志物——片断化降解的DNA进行标记。这一比色系统很适合对组织切片和培养细胞中的凋亡细胞的胞核进行标记，而且还可以同时进行形态学评估。本文展示了DeadEndTM凋亡系统在凋亡的细胞模型、动物模型和多种病理组织切片中的应用。
简介
最初，凋亡定义的是细胞形态学的变化，如细胞体积减少、细胞核浓集和胞膜出泡。经历凋亡的细胞降解成膜彼此相连的凋亡小体，此时，这些凋亡小体可被巨噬细胞或其它临近的细胞所吞噬，而不产生炎症反应。这一过程与坏死完全不同，坏死是细胞遭受严重损伤所导致的，其特征是细胞肿胀、溶酶体酶类释放、细胞膜完整性丧失和炎症反应等。
DeadEndTM比色法凋亡检测系统可以对凋亡细胞的降解DNA进行末端标记。本系统以改进的TUNEL方法为基础，TUNEL为TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end-labeling）的简称。图1所示为检测步骤。DeadEndTM系统对培养细胞和组织切片的DNA降解片段都可进行原位标记。使用这一方法，凋亡细胞核被染成深褐色。
图1. DeadEndTM比色法凋亡检测系统使用方法概述
凋亡的动物模型
凋亡的动物模型对研究体内细胞的程序性死亡通路非常有用。研究人员已经建立了神经元轴索显微手术导致大鼠脑神经元死亡的模型，用于凋亡研究。大鼠脑部视觉皮层的单侧损伤会导致与损伤同侧的外侧膝状体核（LGN）的神经元广泛死亡。经轴索显微手术处理的LGN神经元，在诱导损伤后的精确时间点出现萎缩和死亡。轴索显微手术诱导细胞凋亡的时程表明：损伤后3天，损伤同侧的LGN神经元仅有5%发生死亡；但是，在损伤后3-7天，则出现广泛的神经元死亡。在此期间，背部同侧的LGN约有2/3的神经元出现细胞死亡。在图4中，损伤同侧LGN的多数细胞核都可以被DeadEndTM比色法凋亡检测系统清楚地标记上，而损伤对侧的LGN却未被标记。这些结果清楚地表明这一凋亡检测系统可以有效地标记轴索显微手术诱导的神经元死亡模型的凋亡细胞核。参考文献：Agarwala, S. and Kalil, R. (1998) J. Comp. Neurol. 392, 252.
人类疾病中的凋亡
理解许多疾病状态相关的细胞死亡过程对于解决发病机理和找出可能的治疗方案是至关重要的。在许多疾病中，细胞的死亡是由于凋亡引起还是由其它的溶细胞途径引起，还不十分清楚。我们使用了DeadEndTM比色法凋亡检测系统对几种疾病组织中的DNA降解进行了检测。这种类型的分析能够在组织原位层面上提供细胞死亡机制的信息。凋亡的确认通常需要多方面的证据，如形态学变化和通过DNA laddering证实的核小体降解。使用DeadEndTM比色法凋亡检测系统分析DNA是否降解，是进一步理解疾病状态下的细胞死亡机制的第一步。
移植物抗宿主疾病
移植物抗宿主疾病（GVHD）是骨髓移植的一种严重并发症。在急性GVHD中，皮肤是被攻击的第一靶器官，这种攻击是供体骨髓衍生的淋巴细胞渗透而产生的。最近有研究标明，在该免疫性疾病中，过度的程序性细胞死亡可能与角质细胞受损有关。最终，靶细胞受效应T细胞攻击而受损，被认定是GVHD中的凋亡途径。在实验中，样本为GVHD活检标本，使用福尔马林固定，石蜡包埋，切片的基底细胞层使用DeadEndTM比色法凋亡检测系统进行了标记。效应淋巴细胞致使皮肤损伤，导致GVHD皮肤病变中的角质细胞凋亡，上述实验得到的结果与此结论一致。参考文献：Yoo, Y.H. et al. (1997) Arch. Dermatol. Res. 289, 389
基底细胞癌
基底细胞癌（BCC）是由紫外线照射触发的一种皮肤疾病。虽然BCC生长较慢，并很少发生转移，但是这种肿瘤细胞可能会侵蚀并破坏周围组织。在这种疾病中，正常的程序性细胞死亡会被抑制。一般认为BCC是一种较活跃的高凋亡活性的增殖性损伤。损伤的严重程度依赖于细胞的增殖速率与死亡速率的比值。BCC细胞表达Bcl-2蛋白，后者会抑制细胞凋亡。Bcl-2表达水平的差异可能会影响基底细胞癌的细胞死亡速率。在肿瘤消退的BCC病例中，细胞死亡速率增加。一般认为凋亡会导致肿瘤消退。参考文献：Crowson, A.N. et al. (1996) Human Pathol. 27, 355.
多发性硬化症
当前，对多发性硬化症（MS）脱髓鞘斑的髓鞘和少突细胞的清除机制进行了深入的研究。在多发性硬化症中，脱髓鞘区域所发生的凋亡发挥着重要作用。在此疾病状态下，浸润细胞和小神经胶质细胞发生凋亡，但是少突神经胶质细胞的细胞死亡途径还没有明确。
为了确定MS和其它疾病中发生DNA降解的细胞类型，我们联合使用了比色法的TUNEL技术与抗体着色技术。在细胞增生的慢性MS损伤的脱髓鞘区域，使用Promega的DeadEndTM比色法凋亡检测系统检测细胞凋亡。DeadEndTM检测系统用于标记凋亡的细胞核（黑色），并使用髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白（MOG）抗体进行双标记，以识别少突神经胶质细胞（红色）。图中的凋亡细胞为MOG阴性，因此这些凋亡细胞不是少突神经胶质细胞。
总结
我们已经在凋亡的细胞模型和动物模型上证明了DeadEndTM比色法凋亡检测系统的效用。这种比色系统在检测DNA降解的同时，还可以进行细胞或组织的形态学分析。另外，还证明了DeadEndTM比色法凋亡检测系统对于检测疾病组织中的细胞死亡特别有效。这一系统能够与抗体染色联合使用，用于对某些特定的细胞类型或凋亡途径中的其它分子进行标记。 |
