A.一般操作步骤
1. 融化CellTiter 96 A Queous One Solution Reagent。室温静止90分钟或37℃水浴10分钟，应该可以完全溶解20ml的CellTiter 96 A Queous One Solution Reagent。
2. 在96孔板中，每孔100ul培养基加20μl CellTiter 96 A Queous One Solution Reagent。
注: 推荐以排枪或连续式加样器及数字式加样器加试剂，以保证加样方便准确。
3. 在37℃，5% CO2的环境下孵育1-4个小时。
注: 如果立刻检测就直接进行第4步，如果需要以后检测，每孔加入25ul 10% SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中，最多可保存18小时。然后再进行第4步。
4. 490nm读取吸光度值。
B. 应用举例：用B9细胞检测IL-6 生物活性的操作程序
1. B9细胞在含有5% FBS, 50μM 2-巯基乙醇 (2-ME)和5ng/ml的重组IL-6的培养基中培养，每3天或当细胞浓度达到2×105cells/ml时，以2×104细胞/ml的细胞浓度传代培养细胞，并以IL-6继续处理。
注: 用于生物检测的B9细胞应该在最后一次传代培养后的2天 (以IL-6处理)。
2. 加50μl/孔的IL-6样品或标准品进行检测，以含有5% FBS和50μM 2-ME的RPMI 1640稀释。IL-6的标准液的初始滴定浓度4ng/ml在第12列，进行两倍系列稀释至列2(至4pg/ml)。(在下面的第5步加入细胞悬液后，滴定标准的终浓度将会变为从12列的2ng/ml到第2列的2pg/ml)。使用列1作为阴性对照：加入无IL-6的RPMI 1640培养基(和附加成分)。在37℃，5% CO2的湿箱中平衡平板，同时收集细胞用于实验。
3. 在含有5% FBS和50μM 2-ME的RPMI 1640中离心300g，5 min洗两遍细胞。
4. 确定细胞数和细胞活力(通过台盼蓝染色法)，以含有5% FBS和50μM 2-ME的RPMI 1640重悬细胞至1×105细胞/ml的终浓度。
5. 每孔加50μl细胞重悬液(5,000个细胞)至第2步准备好的平板中。现在每孔总体积应为100μl。
6. 将平板在37℃，5% CO2的细胞培养箱中孵育48–72小时。
7. 每孔加20μl CellTiter 96 A Queous One Solution Reagent。
8. 在37℃，5% CO2的细胞培养箱中孵育1–4小时。
注: 如果立刻检测就直接进行第9步，如果需要以后检测，每孔加入25ul 10% SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中，最多可保存18小时。然后再进行第9步。
9. 490nm读取吸光度值。
10. 绘制曲线：经校正的吸光值在Y轴，生长因子浓度在X轴。确定最大吸光值（峰值）和最小吸光值（无生长因子对照）差值的一半所对应的X轴值；该值即为ED50值(ED50 =产生半数最大反应的所必需的生长因子浓度)。
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