武汉天源慧达生物科技有限公司

　　不可能预计某一个特定siRNA 对目标基因表达的抑制效果。因此，针对每一个目标基因，一般筛选3-5 个不同的siRNA。这些筛选可使用昂贵的合成RNA，或用费时制成的克隆DNA 序列进行。而siLentGene™ U6 盒RNA 干扰系统避免了这些问题，可以较快较容易的筛选多个siRNA 序列。

　　siLentGene™ U6 盒RNA 干扰系统包括制备、纯化和转染siRNA 序列的所有试剂，这些siRNA 处于U6 启动子（这个启动子由基因工程得到，受专利保护）控制下，U6启动子偶联着一个特异的U6 聚合酶终止子。这种设计可以精确转录干扰RNA，并使转录的RNA 带有3’附加碱基。系统提供的U6 盒DNA 是PCR 的模板，同时提供上游引物。模板、上游引物以及下游引物（由客户准备）一起用于PCR 中。下游引物必须包括三个部分：与U6 盒结合区域，能转录成siRNA 序列的区域，和一个U6 终止子序列。

　　siLentGene™ 系统操作流程概览

　　1.设计和合成含有合适干扰序列的下游DNA 引物（下游引物A 和下游引物B）

　　2.用siLentGene™ PCR DNA 纯化系统纯化PCR 产物。

　　3.转染混合的纯化PCR 产物进恰当的细胞系。

　　4.使用所选择的方法（例如，Western 分析，酶活性或免疫细胞化学）分析RNA 干扰。

　　合成的PCR 产物，即U6 表达盒，包括了U6 启动子，靶标序列或靶标序列的互补序列，和一个终止子序列。在这个实验中必须制备两个表达盒，一个表达反义siRNA另一个表达有义siRNA。经过过柱纯化后，将两个表达盒合在一起，再使用siLentGene™转染试剂转染合适的细胞系（图1）。普洛麦格公司经实验确定这个试剂为转染小片段DNA 的最佳试剂，我们不推荐在这个实验中使用其它转染试剂。请参考第VI 部分优化转染反应的细节。

　　转染之后，内源U6 聚合酶从每一个PCR 产物转录单个短RNA。得到的两个互补RNA 经退火，形成siRNA 二聚体。siRNA/ RISC 复合体在细胞内形成，并导致靶标mRNA特异降解。RNA 干扰的效果可以用不同的技术进行分析。第VII 部分讨论了用U6 表达盒获得的典型的干扰结果。

　　这个系统有下列特点：

　　方便：可在几小时内制造出能评估好几个siRNA 效果的不同的U6 表达盒。

　　价格不贵：使用DNA 寡聚核苷酸，是dsRNA 寡聚核苷酸价格的四分之一。

　　快速：无须制备转染级别的质粒或筛选插入片段。

　　高效：观察到的抑制效果与用以U6 载体为基础的系统相同。

　　易用：以DNA 为基础，不须操作RNA。

　　产品组分

　　每一个系统包含的试剂足够20 个标准的150ul 扩增反应。可以进行10 个siRNA 序列（包括靶标和对照）的评估。全系统包含三个独立的部分，每一个部分的储存条件都不同。

　　C7801：siLentGene™ U6 盒系统

　　　　　􀁺 60ul 　　　siLentGene™ U6 盒 DNA

　　　　　􀁺 60ul 　　　siLentGene™ U6 盒上游引物