Promega提供的NanoLuc^®萤光素酶和Nano-Glo^® Fluorofurimazine In Vivo Substrate（体内成像底物）可用于体内生物发光成像，以研究AAV突变体在小鼠体内的分布和转导效率，进一步探究AAV载体的免疫原性。

    重组腺相关病毒（AAV）载体是体内基因治疗的一种具有吸引力的递送策略，但也面临着一个巨大的挑战：如何避免被一直警惕的免疫系统检测到（1,2）。为了补偿对这些病毒颗粒的免疫反应，已经采取了包括免疫抑制药物和改造AAV载体使其提高效力从而最小化有效剂量等措施。然而，这些方法也带来了各自的挑战，并不能直接解决AAV载体诱导免疫反应的倾向。

    最近的一项研究引入了一种新方法来减少AAV载体固有的免疫原性（2）。研究人员有策略性地置换了AAV衣壳蛋白中的氨基酸，以消除T细胞识别的特定序列（能够引发最强烈的免疫反应）。结果，他们显著降低了AAV载体的T细胞介导的免疫原性和毒性，而不影响其性能。

    为了量化改良后的AAV9衣壳蛋白的行为，研究人员将NanoLuc^®报告基因插入AAV载体中。在制备含有改良的AAV9衣壳蛋白的病毒颗粒时，他们观察到与使用母体AAV9衣壳蛋白制备的病毒颗粒相比，病毒颗粒的质量或性能没有任何差异。此外，这些改良并没有影响载体将NanoLuc^®报告基因递送至细胞的能力，也没有影响抗AAV抗体中和载体的能力。

    在这些体外实验之后，研究人员将携带NanoLuc^®报告基因的突变AAV9载体注射到小鼠体内。他们通过连续几周注射NanoLuc^®萤光素酶活体成像底物NanoGlo^® Fluorofurimazine，并通过活体生物发光成像检测方法来测定萤光素酶的表达。注射了突变AAV9载体的小鼠的萤光素酶表达水平与注射了亲本AAV9载体的小鼠相似。更重要的是，萤光素酶表达可在注射后的29天内保持稳定。

    Nano-Glo^® Fluorofurimazine In Vivo Substrate（FFz）专为体内检测NanoLuc^®萤光素酶而设计。可在其promega产品页面上找到其他使用FFz进行活体成像的研究案例。

    AAV载体对特定的组织和器官具有选择性，这种特性称为嗜性。研究人员发现，亲本AAV9载体在小鼠的肝脏、心脏和胸腺中高表达NanoLuc^®报告基因。而AAV5载体在这些器官中的表达受限，仅限于小鼠的肝脏和肺部。相比之下，突变的AAV9载体显示出与亲本AAV9载体相似的分布和表达水平。

    最终，研究人员发现，不同于之前用野生型AAV9扩增的PBMCs，突变型AAV9载体扩增的PBMC用突变型AAV9肽再次刺激能引发较低水平的免疫激活。

    综上所述，这些结果表明研究人员能够有计划地修改AAV载体，以避免不良的免疫反应，同时保持载体功能。他们相信他们的方法可以用于“免疫沉默”其他AAV载体，并改善体内基因疗法。